Células de Stem

Las células limbales Stem o madres son pobremente diferenciadas, de ciclo celulares lentos y con una gran capacidad para la expansión clonogénica y división libre de errores. Ellas se renuevan a si mismas, pueden proliferar indefinidamente, y sobreviven por la duración del órgano o organismo en el cual residen. Usualmente están confinadas a su "nicho", una localización específica en el órgano donde el micro ambiente le da soporte, mantiene sus características y ofrece un grado de protección.

Las características dadas a las células stem o madres son su potencialidad y plasticidad -que es la habilidad de dar origen a múltiples líneas celulares y a diferenciarse en tipos celulares totalmente diferentes, cuando son recolocados en un nuevo nicho de células ítem.(1)

Las células Stem son una pequeña subpoblación del total del tejido. Potten y Loeffler las definen por sus atributos funcionales, como células indiferenciadas capaces de:

• Proliferar.
• Auto-mantenerse.
• Producir un gran número de progenie diferenciada y funcional.
• Regenerar el tejido después de un daño.
• Tener flexibilidad en el uso de estas opciones.(2)

La división celular de las células stem puede ser asimétrica o simétrica. Cuando la división celular es obligatoriamente asimétrica, una de las células hijas se mantiene como su progenitora, y sirve para renovar el pool de células madres, la otra hija está destinada a dividirse y diferenciarse con la adquisición de las características del tejido específico.

Hay una célula llamada "célula amplificadora transitoria", es menos primitiva que su célula madre progenitora. Se dividen más frecuentemente que las células madres, pero tienen un potencial proliferativo limitado y son consideradas el paso inicial para la diferenciación final.

La aumentada capacidad proliferativa de las células amplificadoras transitorias tiene las ventajas de:

• Amplificar cada división de la célula madre y minimizar la necesidad de proliferación de las mismas.
• Minimizar el chance de introducir errores en el ADN replicado, en la población de células stem.
• Proporciona nuevas células que están más cercanas a la diferenciación final, y al comportamiento celular
• funcional, por ejemplo, el epitelio que cubre el centro de la córnea.

Identificación y localización de las células Stem limbales

Actualmente no se ha identificado ni a las células stem, ni a sus nichos específicos en el limbo, en parte por la falta de un marcador celular específico. La mayoría de los nichos de las células madres están localizadas profundamente en el tejido soporte que ellas diferencian.(1)

Hay evidencia clínica y experimental que prueba la localización de las células stem del epitelio corneal en la región limbal. El concepto de que las células epiteliales en la región limbal están involucradas en la renovación del epitelio corneal fue propuesto primero por Davanger y Evensen en 1971. En la cicatrización de defectos epiteliales corneales excéntricos en ojos muy pigmentados, ellos observaron líneas (células) de migración epitelial pigmentadas que migraban de la región limbal hacia el centro de la córnea. Ellos sugirieron que la estructura papilar limbal (palizadas de Vogt) sirven como órgano generador de células epiteliales corneales.(2). Vogt describió estas criptas perpendiculares a la conjuntiva corneal perilimbal.(3) Schemer y colaboradores proponen un esquema de proliferación celular epitelial para la córnea como sigue: células básales limbales (células madres) epitelio corneal basal (células amplificadoras transitorias) epitelio corneal suprabasal (células diferenciadas).(4)

La evidencia actual de la localización limbal de las células stem se resumen en:

• El epitelio basal limbal contiene las células menos diferenciadas del epitelio corneal. Las células epiteliales contiene diferentes tipos de queratina, algunas de las cuales indican un alto nivel de diferenciación.
• Estudios han demostrado que el índice mitótico del epitelio corneal tiende a ser mayor hacia la periferia, sugiriendo que las células básales corneales de la periferia son mas activa en la síntesis de ADN.
• Por la preponderancia relativa de las neoplasia limbales y tumores epiteliales corneales, asumiendo que la neoplasia se origina principalmente de células relativamente indiferenciadas.

Las ventajas funcionales de esta localización, son que debido a que la córnea central es transparente, sus células básales están desprovistas de pigmento, por lo que son más propensas al daño solar. Las células básales en la región limbal son muy pigmentadas y por ello están bien protegidas. Esta transparencia también determina una unión epitelio-estroma más suave, susceptible a desgarros. El epitelio limbales es muy resistente a las fuerzas de desgarro y muestra una unión epitelio-estroma fuerte.(2)

Deficiencias de las células Stem (madres) limbales

Numerosas condiciones están asociadas con deficiencia de células Stem o madres.
Estas incluyen:

• Por aplasia: pérdida total de las células stem debido a una destrucción primaria
  

  Traumáticas

  Daño químico Daño térmico Inducido por lente de contacto

  Iatrogénicas

  Cirugías limbales múltiples Medicamentos tópicos utilizados a largo plazo (por toxicidad)

  Auto-immunes

  Síndrome de Stevens-Johnson Penfigoide Ocular cicatricial Queratocojuntivitis Atópica

• Por hipofunción: pérdida gradual de la función de las células Stem por soporte estromal insuficiente:
  

  Congénitas:

  Aniridia Displasia Ectodérmica Síndrome de queratitis–ictiosis–sordera Queratitis asociada con deficiencias endocrinas múltiples

  Neural o isquémicas:

  Queratopatía neurotrófica

  Inflamatorias e infecciosas:

  Limbitis crónica Queratitis ulcerativa corneal periférica

  Otras:

  Pterigión y pseudo pterigión Ideopática (5-6)

Presentación clínica

La deficiencia de células limbales madres está asociada con:

• Defectos epiteliales persistentes
• Vascularización de la córnea
• Cicatrización corneal
• Adelgazamiento corneal, ulceración y perforación corneal
• Calcificación corneal
• Queratopatía en banda

Los síntomas incluyen:

• Disminución de la agudeza visual
• Fotofobia
• Lagrimeo
• Blefaroespasmo
• Episodios recurrentes de dolor
• Historia de inflamación crónica y ojo rojo

El diagnóstico de la deficiencia de células limbales madres es crucial ya que estos pacientes generalmente son malos candidatos para el transplante corneal convencional.(7)

Diagnóstico por citología:

Categoría 1: Aplasia o pérdida total de células madres por destrucción. Además de la conjuntivalización, evidenciada por la presencia de células globet conjuntivales en la superficie corneal. El intervalo entre el daño y el diagnóstico citológico va desde 2 semanas a 70 años.

Categoría 2: Hipofunción: pérdida gradual de la función de las células stem por soporte estromal insuficiente, no se pierde población de células stem como resultado de una destrucción, el micro ambiente estromal es insuficiente para darle soporte a las funciones celulares. Presentan cambio corneales similares: pannus superficial, tinción con fluoresceína irregular, células globet ectópicas conjuntivales en la superficie corneal, atenuación de la membrana de Bowman. Indicando que las funciones de las células madres pueden ser moduladas por factores de desarrollo, hormonales, neurales, vasculares e inflamatorios en el estroma limbal.(8)

Tratamiento quirúrgico

Evaluación preoperatorio

La escogencia del tratamiento y el pronóstico para una cirugía exitosa, depende de múltiples factores, los cuales incluyen:

• El grado de pérdida de células limbales madres.
• La extensión de la enfermedad conjuntival.
• La presencia y etiología de la inflamación conjuntival.

Otros factores a tomar en cuenta son:

• La lateralidad de la enfermedad.
• Deficiencia de la película lagrimal
• La presencia o ausencia de queratinización.
• Alteraciones palpebrales asociadas.
• La presencia o ausencia de glaucoma.
• La edad y salud general del paciente.(5)

Los pacientes con enfermedades unilaterales típicamente tienen visión normal en el ojo no afectado, y no requieren un tratamiento quirúrgico para sus actividades diarias. Sin embargo, frecuentemente escogen un tratamiento quirúrgico por dolor crónico, razones cosméticas o requerimientos ocupacional. En estos pacientes se tiene la posibilidad de poder usarse el ojo sano como fuente de células madres limbales. Esto elimina el riesgo de rechazo del injerto y la necesidad de inmunosupresión sistémica.(5)

La extensión de deficiencia de células limbales esta relacionada con la severidad de la enfermedad. Pacientes con pérdida parcial de células limbales (por ejemplo, daño iatrogénico, quemadura moderada) puede ser frecuentemente tratada médicamente o con una epiteliectomia conjuntival. Pacientes con una enfermedad más extensa requiere de transplante de células madres para restaurar una superficie ocular saludable.

El grado de compromiso conjuntival es otro factor determinante para el transplante de células limbales. Se puede asociar una deficiencia del componente mucínico de la lágrima, fibrosis subepitelial, simblefaro, anquiloblefaro y acortamiento de los fornices. En casos severos, se presenta la queratinización de toda la superficie. Holland, en 1996, mostró que la queratinización de la conjuntiva como factor de riesgo para la falla del transplante queratolimbal. La presencia de enfermedad conjuntival limita las opciones quirúrgicas, aumenta las dificultades técnicas de la cirugía y aumenta el chance para la falla del transplante de células limbales.(5)

Igualmente, la presencia de la deficiencia del componente acuoso de la lágrima puede afectarlo adversamente. Shimazaki ha demostrado previamente que la disminución de la secreción lagrimal puede ser un factor de riesgo significante para la falla del transplante de las células madres en pacientes con síndrome de Steven-Jhonson. Estos pacientes requieren frecuentemente lágrimas artificiales, oclusión de los puntos lagrimales y una tarsorrafia lateral para maximizar la salud de la superficie ocular.(5)

Pacientes con inflamación conjuntival activa tienen un peor pronóstico con el transplante de células madres. Los daños químicos eventualmente requieren tiempo y la cirugía debería posponerse hasta que la inflamación pueda controlarse. Pacientes con penfigoide cicatrizal o síndrome de Steven Jhonson, sin embargo tienen una inflamación crónica persistente.(5)

Evolución del transplante de la superficie ocular

Ha evolucionado desde el primer transplante conjuntival descrito por Thoft en 1977 y la queratoepitelioplastia por Thoft en 1984. Estos procedimientos no fueron utilizados para el transplante limbal porque no se conocía la teoría de las células stem o madres para ese entonces. Numerosas técnicas quirúrgicas son ahora descritas para la aplicación clínica de la teoría de las células madres limbales para el manejo de pacientes con una enfermedad severa de la superficie ocular. Múltiples términos han sido utilizados en estudios previos, incluyendo transplante conjuntival autólogo, alo transplante conjuntival, auto transplante conjuntival limbal, alo transplante limbal, homo transplante de células limbales madres.(5)

El uso de conjuntiva antóloga para el cubrimiento de córneas quemadas químicamente fue descrita inicialmente por Thoft en 1977. El éxito de este procedimiento se apoya en la disponibilidad de epitelio conjuntival sano del otro ojo no dañado, el cual cuando se transplanta al ojo quemado, migrara sobre el estroma, adhiriéndose firmemente, y eventualmente asumiendo las características bioquímicas y morfológicas del epitelio corneal normal, un proceso denominado "Transdiferenciación conjuntival".(9) El cual postula que el epitelio conjuntival puede transformarse en epitelio corneal.(4) Sin embargo, ahora se sabe que esto no ocurre y el transplante de epitelio conjuntival para restaurar la superficie corneal en pacientes con deficiencia de células madres se ha abandonado.(10) El uso del transplante conjuntival se extendió a otros desordenes oculares, incluyendo pterigión recurrente, reconstrucción de fornices, estrabismo cicatrizal, inflamación postoperatoria crónica, defecto epitelial persistente y queratopatía relacionada con lentes de contacto.(9)

Los procedimientos varían en la fuente del tejido donador y en el tejido utilizado como medio de transporte para el transplante de las células madres. Sin embargo, la estabilización de la superficie corneal es el objetivo de todos estos procedimientos. Holland y Schwartz han propuesto un sistema de clasificación basado en la fuente del donador (auto injerto vs. alo injerto) y del tejido utilizado.(4) Para enfermedades unilaterales: el auto injerto conjuntival limbal puede ser la mejor opción. Para enfermedades bilaterales, fuentes alogénicas de células madres son requeridas. Las opciones incluyen un alo injerto conjuntival limbal de un familiar vivo, un alo injerto queratoconjuntival de un donador muerto, una combinación de ambos, y un alo injerto limbal cultivado ex vivo.(5)

Las células limbales autólogas son empleadas para reestablecer una superficie ocular epitelial en situaciones en las cuales hay una destrucción extensa de las células limbales madres. La transferencia de células limbales madres optimiza la potencial rehabilitación de córneas con pérdida total o daño permanente del epitelio corneal y limbal.(11)

El daño químico continúa siendo la indicación más común. Los daños químicos severos pueden ocasionar una pérdida completa del epitelio corneal y de las células madres, así como el epitelio conjuntival, por lo que se requiere una reparación desde la conjuntiva de los fornices.(11)

Procedimientos quirúrgicos

Autoinjerto conjuntivo limbal

El uso del transplante autólogo limbal fue descrito primero por Strampelli en 1960 y luego por Barraquer en 1964.(12)

El auto injerto conjuntivo limbal puede ser utilizado en pacientes con deficiencia de células madres unilateral. Estas condiciones incluyen daño químico o térmico, deficiencia iatrogénica y neoplasias. El tejido limbal conjuntival es obtenido del otro ojo no afectado. Kenyon y Tseng en 1989 fueron los primeros en publicar sus resultados en 21 pacientes. Esta modificación del transplante conjuntival de Thoft incluía extender los injertos de conjuntiva bulbar, 0,5mm en córnea clara y por ende obtener células limbales. Los diagnósticos preoperatorios incluían: daño químico crónico, daño térmico, queratopatía inducida por lente de contacto y deficiencia iatrogénica. La mayor complicación de este procedimiento es inducir una deficiencia de células madres de ese ojo. Estudios en animales han mostrado que la remoción parcial o de espesor parcial del epitelio limbal puede producir un cuadro clínico consistente a una deficiencia de células madres que conlleva a una cicatrización de la herida corneal epitelial anormal. El riesgo parece disminuir si el ojo donador esta realmente sano (por ejemplo, no uso prolongado de lente de contacto ni una exposición subclínica al trauma original) y tomar menos de 6 horas de tejido limbal. El auto injerto conjuntivo limbal es actualmente ampliamente aceptado como procedimiento para el tratamiento de una deficiencia limbal unilateral. El mayor beneficio es la ausencia de rechazos, por lo que se elimina la necesidad de inmunosupresores sistémicos. También proporciona una conjuntiva sana no inflamada y con células limbales madres. Sin embargo, no es una opción para pacientes con enfermedad bilateral, requiriéndose una fuente alternativa de tejido donador para estos pacientes severamente afectados.(5)

Alo injerto conjuntivo limbal de un familiar vivo

Descrito por Kenyon y Reposa y lo denominaron transplante de un aloinjerto limbal, la técnica quirúrgica es similar al transplante conjuntival autólogo. La fuente del tejido es de un ojo de un familiar vivo. Este puede realizarse en todo donador potencial para encontrar la mejor compatibilidad. Donadores potenciales con glaucoma quienes pueden requerir de una trabeculectomia o tienen historia de uso prolongado de lente de contacto deben ser excluidos. Las pruebas serológicas de los donadores potenciales incluyen HIV-1 y -2, y hepatitis B y C. Este procedimiento tiene la ventaja de proporcionar células limbales madres mientras tiene cierto grado de histocompatibilidad. El riesgo del rechazo existe y los pacientes requieren ser inmunosuprimidos sistémicamente.5

En los alo injertos limbales puede recurrir la alteración de superficie si hay destrucción inmunológica de las células stem transplantadas. Una alta tasa de reacciones inmune puede ser esperada por el gran estímulo inmunológico del transplante limbal, relacionadas a una abundancia relativa de células de Langerhans y antígenos HLA-DR. Ellos juegan un papel importante en la vía aferente del rechazo del aloinjerto y una inmunosupresión efectiva es absolutamente necesaria.(7)

Aloinjerto queratolimbal

Es utilizando las células madres de un transplante alogenito cadavérico, con la cornea periférica como tejido transportados. Se desarrollo a partir de la técnica de queratoepitelioplastia descrita por Thoft en 1984. El tomaba la córnea periférica de un ojo de un cadáver y lo suturaba alrededor del limbo del paciente. El tejido limbal no era obtenido específicamente con este procedimiento pero este podía obtenerse con el tejido corneal periférico. Thoft y colaboradores modificaron esta técnica en 1990 para incluir tejido limbal. En 1994 Tsai y Tseng describieron una modificación a la técnica de Thoft a la que llamaron transplante de un aloinjerto limbal. Todo un globo ocular era utilizado y un anillo de tejido limbal era cortado usando un trepano de succión. En 1995 Tsuboto y colaboradores fueron los primeros en reportar el uso de segmento de anillos corneoescleral para el transplante de células madres limbales. Holland y colaboradores, modificaron la técnica de Tsubota utilizando dos fragmentos de anillos corneoesclerales.

Técnica: la cornea central es trepanada con trepano de 7,5mm. El anillo es cortado en dos mitades y el exceso de esclera periférica es removido. Luego se realiza una disección lamelar para remover la mitad a dos tercios del estroma, membrana de Descement y endotelio, esto se repite en el segundo anillo corneoescleral. El ojo receptor es preparado, se le realiza una peritomía conjuntival en 360º. Las áreas de simblefaro son liberadas del limbo. La conjuntiva es resecada a 4 a 5 mm del limbo y el exceso de Tenon es cortado. Se realiza una queratectomía superficial para remover la conjuntiva anormal que lo cubre sin alterar las capas estromales más profundas. Membrana amniótica puede colocarse en este momento. La membrana amniótica ha demostrado reduce la inflamación y la cicatrización y facilita la epitelización. El tejido con las células limbales es asegurado al ojo con sutura de Nylon 10-0, con el borde corneal justo cubriendo el limbo receptor. Se debe asegurar que los márgenes corneales terminen con los de la cornea receptora. Segmentos adicionales son colocados terminación con terminación para dar una cobertura en 360º. Este procedimiento tiene la ventaja sobre los anteriores que un gran número de células limbales son transplantadas, y la cobertura en 360º proporciona una barrera contra la invasión conjuntival.

El alo injerto queratolimbal es el procedimiento de elección en pacientes con enfermedad limbal primaria con mínimo involucro conjuntival (Ej. aniridia). Debe realizarse en pacientes con enfermedad unilateral quienes prefieren no operarse el otro ojo y en pacientes con leve a moderada alteración conjuntival. Ya que este procedimiento no proporciona conjuntiva, los pacientes con una deficiencia total de células madres y una inflamación conjuntival y cicatrización activa pueden beneficiarse con una aloinjerto conjuntivo limbal de un familiar vivo más este procedimiento.

Si el defecto epitelial persistente esta acompañado por isquemia limbal, el transplante limbal autólogo puede restaurar la vascularización limbal, la cual previene de una subsiguiente ulceración corneal estéril. En estos casos, aunque la neovascularización corneal ocurre frecuentemente, a medida que disminuye la inflamación y el epitelio corneal se estabiliza, los vasos estromales regresan o involucionan. Esta combinación de factores mejora el pronóstico de una queratoplastia lamelar o penetrante, la cual puede realizarse para una rehabilitación visual definitiva no antes de 6 meses después del transplante de células limbales.(11)

Muchas publicaciones han reportado un éxito inicial en la restauración de la superficie ocular con este procedimiento. Otras han reportado la dificultad en mantener una superficie ocular saludable en estos pacientes. Tseng y col. Han reportado una tasa de sobrevida de 77% al año, 47% a los 3 años y solo el 25% a los 5 años. Aunque no es estadísticamente significativo, realizar una queraoplastía simultanea con el alo injerto queratolimbal fue asociado con una reducción de la sobreviva de alo injerto queratoconjuntival después de 2 años. Para evitar un rechazo, los autores posteriormente agregaron prednisolona y micofenolato mofetil (CellCept) en su régimen. Ilari y Daya reportaron una tasa de sobrevida del injerto del 54% en un año, 33% en 2 años y de un 27% en 3 años. Inicialmente solo los pacientes con alto riesgo fueron tratados con ciclosporina A sistémica la cual mejoraba la sobreviva del injerto pero no previene los episodios de rechazo agudo. La queratoplastia fue exitosa en un 65% de los pacientes casi todos los pacientes recibieron una inmunosupresión triple.(5)

Alo injerto limbal conjuntival de un familiar vivo combinado con un alo injerto queratolimbal

Pacientes con una enfermedad mas severa de la superficie ocular incluidos aquellos con un déficit total de células limbales madres y deficiencia conjuntival. Esto incluye a pacientes con un síndrome de Steven-Jhonson, penfigoide ocular cicatrizal y daños químicos severos. En estos pacientes, la pérdida de células madres está acompañada por un déficit de mucina en la lágrima, simblefaro, anquiloblefaro y acortamiento de los fornices. Estos pacientes se beneficiarían con un trasplante conjuntivo-limbal para restituir el tejido limbal y conjuntival. Un numero limitado de células madres pueden adquirirse de un donador y la persistencia de la área de unión puede llevar a una conjuntivalización de la superficie. Se ha tenido éxito usando la combinación de cirugías para restaurar la superficie ocular saludable en estos pacientes.

El tejido limbo-conjuntival es obtenido del familiar más compatible y se coloca en un medio de preservación. El ojo receptor es preparado para un alo injerto queratolímbico normal. Un anillo corneoescleral es utilizado para obtener dos fragmentos. El tejido conjuntival es colocado superior e inferiormente. El tejido queratolimbal es utilizado para llenar las uniones nasal y temporalmente. Este tiene la ventaja de prever tejido conjuntival y más células madres y crear una barrera de 360º a la conjuntiva invasora. Como con todo alo injerto se necesita una inmunosupresión sistémica para los dos tipos de tejido antigénico utilizados.

Expansión ex-vivo de células Stem

El transplante de epitelio corneal cultivado autólogo o alogénico se ha desarrollado recientemente para el tratamiento de paciente con fallas en la superficie ocular.(5)

Tsai y colaboradores fueron los primeros en reportar su utilización, ellos utilizaron tejido limbal autólogo obtenido por biopsia del ojo contra lateral para cultivar en membrana amniótica críopreservada y reportaron una tasa de éxito del 83% de un aumento de la agudeza visual y del 100% en lograr una reepitelización sin revascularización con un seguimiento de 15±2 meses.(13)

Koizumi y colaboradores concluyeron que el transplante de epitelio corneal cultivado usando membrana amniótica d esnuda como transporte puede ser usada para deficiencias severas de células limbales madres, estudio realizado en 13 ojos, manteniéndose la superficie corneal clara, aunque 3 ojos presentaron rechazo.(14) Shimezaki et al reportaron 13 ojos de 13 pacientes con una deficiencia total de células madres limbales que fueron transplantados con tejido limbal cultivado de un donador alogénico y de un familiar. Ellos reportaron una restauración epitelial corneal de un 46.2%.(13)

Manejo postoperatorio

Es el aspecto más importante para el éxito o falla del procedimiento. Los corticoesteroides tópicos y la ciclosporina A tópica son utilizados para reducir la inflamación. La función del componente acuoso de la lágrima debe ser maximizada con oclusión de los puntos lagrimales y con lágrimas artificiales libres de preservantes. La tarsorrafia debe realizarse cuando hay un retraso en la epitelización para minimizar la exposición y la evaporación.(5)

Queratoplastia post aloinjerto queratolimbal

En pacientes con cicatrización estromal significativa, la queratoplastia es necesaria. Se recomienda por lo general esperar por lo menos 3 meses después del alo injerto queratolimbico para la estabilización de la superficie ocular. Las cornea donadoras deben seleccionarse cuidadosamente para no utilizar corneas con anormalidades epiteliales. Excepto en emergencias, la queratoplastia puede realizarse en conjunto con el alo injerto queratolimbico, ya que estudios reciente han demostrado un mayor riesgo para el rechazo cuando son realizadas simultáneamente.(5)

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